各种凝胶在结构上是很相似的，都是三维空间网状交织的高分子聚合物。分离程度主要取决于凝胶颗粒内部微孔的孔径和混合物的分子量这两个因素。微孔孔径的大小与凝胶物质中凝胶浓度的平方根呈反比，与凝胶聚合物分子的平均直径呈正比（其聚合物分子近似地当做球形）。和凝胶孔径直接关联的是凝胶的交联度，交联度越高，孔径越小；反之，孔径就大。移动缓慢的小分子物质，在低交联度的凝胶上不容易分离，大分子同小分子物质的分离也宜用高交联度的凝胶。葡聚糖凝胶的交联度随每克干燥凝胶的吸水量的增加而递减。

根据具体实验情况决定洗脱液的流速，一般采用30~200mL/h。流速过快会使色谱带变形，影响分离效果，流速的调节可采用静液压法装置。

非水溶性物质的洗脱，采用有机溶剂，水溶性物质的洗脱，一般采用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。离子强度的变化，对于物质的分离有不同的影响。在洗脱碱性蛋白时，洗脱剂中必须含有一定浓度的无机盐，而且随着盐浓度的增加，移动加快。pI低于7的蛋白质的洗脱，很少受离子强度变化的影响。在酸性pH时，碱性物质易于洗脱。多糖类物质洗脱以水最佳。

凝胶色谱很少用在分离纯化的开始阶段。为了达到良好的分离效果，柱子的上样量必须保持较小的体积。对于蛋白质来说，上样量通常为柱体积的2%~5%。样品中含有杂质太多时就有可能堵塞柱子。凝胶色谱通常用在分离纯化的最后阶段，此时的目的产物已经比较纯，浓度较高。样品加到色谱柱后，选用合适的洗脱液进行洗脱，通常目的产物被稀释很多倍。