被常规样品污染的硅胶基质反相色谱柱，已有各种清洗与再生方法。月旭科技在对普通常规反相柱子的异常冲洗中，一般建议客户用甲醇-乙腈-异丙醇-乙腈各项冲洗20倍柱体积的方法进行冲洗。

市面上也有些公司推荐使用一些更强溶剂的洗脱方式。如用二氯甲烷：甲醇（96:4，V/V），加1%氢氧化铵冲洗，其中加入的氢氧化铵对聚集在柱头的污染物具有良好的清洗效果。再如，在用水冲洗色谱柱同时进4等份的200μL二氯甲砜，然后依次用甲醇、氯仿和甲醇冲洗。用N，N-二甲基甲酰胺、丙酮依次冲洗色谱柱。这些方法耗时短，但使用的特殊溶剂，如氢氧化铵、二氯甲砜、N，N-二甲基甲酰胺等，均对色谱固定相有一定的损伤。

2、金属离子污染色谱柱的清洗

当色谱柱被金属离子污染后，一般的清洗方法无法生效，需要用特殊的清洗方法。磷酸和0.1mol/L柠檬酸对色谱柱上吸附的金属离子具有较好的清洗效果，因此常被人们用来清洗被金属离子污染的色谱柱^[1]乙二胺四乙酸（EDTA）能同许多金属离子形成配合物，0.05mol/L的EDTA水溶液也可以用来去除色谱柱中金属离子污染物。

这些试剂虽然能去除金属污染物，但也存在一些缺陷，如水溶液对固定相的浸润性较差，清洗效果不太理想；磷酸对固定相上键合相有一定的破坏作用；EDTA带入钠离子，对固定相性能产生影响。

3、蛋白质污染色谱柱的清洗

蛋白质分子量大，同时具有亲水和疏水特性，对很多物理和化学因素敏感。一般情况下，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能很好溶解多肽和蛋白质，不能有效地清洗色谱柱，因而需要一些特殊的清洗方法。

现常用方法是用不含缓冲盐的流动相-0.1%TFA（三氟yi酸）水溶液-乙腈：异丙醇（1:2，V/V，含0.1%TFA）各项冲洗20倍柱体积，或用0.1%TFA（三氟yi酸）：乙腈（1:1，V/V）用0.2mL/min流速，过夜冲洗色谱柱。

当上述方法无效时，可使用一些苛刻的试剂，如盐酸胍、二甲基甲酰胺及表面活性剂等。如用50%异丙醇水溶液冲洗时，将6mol/L盐酸胍水溶液与异丙醇按1:1混合，进样250μL；或者用30%二甲基甲酰胺水溶液清洗，时间不超过30min，处理后反复用水、甲醇冲洗。在常规流动相冲洗色谱柱时，注射500μL的1%十二烷基硫酸钠（SDS），然后用5%~95%乙腈水（含0.1%TFA）梯度冲洗，去除蛋白污染物效果也较好。^[2]若已确定蛋白质污染种类，可将对应蛋白水解酶（如1%胰蛋白酶或木瓜蛋白酶）注入色谱柱，将蛋白质水解为肽，再用盐溶液洗脱。

蛋白质污染色谱柱，不论是用高浓度的磷酸盐溶液，还是用尿素或胍来清洗色谱柱，对色谱柱都会产生较大损伤，同时损害色谱仪器。其中使用注射1%SDS法清洗色谱柱，不仅节省时间，还能得到较好的效果，是现有清洗方法中较优的选择。

离子交换色谱柱在ji端pH范围和高盐浓度条件下长时间使用，或者分析蛋白等生物类样品后，盐离子及蛋白质会吸附于固定相表面，导致色谱柱分离能力下降，柱压升高，峰形变差。

对于污染的离子交换色谱柱，月旭科技的Ultimate^® XB-SCX和Ultimate^® XB-SAX建议用不含有缓冲盐的流动相-10%甲醇冲洗20倍柱体积。

若常规的方法无法改善色谱柱性能的，可根据色谱柱性质及具体污染情况，选择强酸性或强碱性溶液、高盐溶液、含有机溶剂的缓冲溶液、含尿素等溶剂或表面活性剂（非离子型表面活性剂）的缓冲盐溶液、某些蛋白质变性剂（如盐酸胍和尿素等）以及蛋白酶中一种或几种组合进行清洗和再生。

体积排阻色谱是基于分子尺寸大小将物质分离的一种色谱模式。

月旭Xtimate^® SEC的柱子，日常的冲洗建议用10%乙腈或5%乙腈-90%乙腈冲洗20倍柱体积。但当多次使用后，某些样品可能会吸附到入口筛板或填料上。当积累至一定程度时会出现压力升高并伴随峰形展宽的异常现象，需要进行特殊的冲洗。该冲洗的清洗溶液选择的基本原则：1）低pH的盐溶液有助于移除碱性蛋白；2）有机溶剂有助于移除疏水蛋白；3）助溶剂有助于去除在固定相上强吸附的物质（如通过氢键作用等）。

注意：只有在中性盐溶液或有机溶剂没有明显改善效果的情况下，使用助溶剂（如：6-8M的尿素或0.2-0.3%十二烷基硫酸钠）。

参考文献

[1] 张玉奎，张维冰，邹汉法. 分析化学手册[M].第6分册.液相色谱分析。北京：化学工业出版社，2000.

[2] Ralph A Grohs，F Vincent Warren Jr, Brain A Bidlingmeyrer. Analysis of drugs in the presence of serum albumin by liquid chromatography with eluents containing surfactants [J]. Anal Chem, 1991, 63(4): 384-390.